ĐẶT VẤN ĐỀ

Vô sinh hiếm muộn là vấn đề ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của nhiều cặp vợ chồng trên toàn thế giới. Tỷ lệ vô sinh trên thế giới trong khoảng 6 - 12% cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản; ở Việt Nam, tỷ lệ vô sinh là 7,7%¹. Nguyên nhân vô sinh ở các cặp vợ chồng do nam giới là 40%, do nữ giới là 40%, 10% do cả hai và 10% không rõ nguyên nhân². Để bảo tồn khả năng sinh sản của nam giới, các Trung tâm Hỗ trợ sinh sản sử dụng kỹ thuật bảo quản lạnh tinh trùng. Nguyên lý của kỹ thuật này là làm môi trường nước ở trong và ngoài tế bào biến đổi thành thể rắn, tức là làm ngừng chuyển động của các phân tử và các quá trình sinh học trong tế bào. Mục tiêu của bảo quản lạnh là sau khi đưa về nhiệt độ 37°C, tế bào vẫn có thể trở lại hoạt động sống bình thường, không bị ảnh hưởng về cấu trúc và chức năng³.

Tại Trung tâm Chẩn đoán trước sinh và Hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên thực hiện kỹ thuật xét nghiệm tinh dịch đồ, lọc rửa tinh trùng để bơm vào buồng tử cung hỗ trợ cho những cặp vợ chồng hiếm muộn. Trong quá trình thực hiện nhận thấy một số trường hợp người chồng khó xuất tinh, thể tích tinh dịch quá ít hoặc người chồng có lịch công tác đột xuất hay không thể có mặt vào ngày lấy tinh trùng để bơm; do đó nhu cầu lưu trữ bảo quản tinh trùng trong thời gian ngắn là cần thiết. Hiện nay, bảo quản tinh trùng lạnh sâu thường quy tại các Trung tâm Hỗ trợ sinh sản trong nước và quốc tế sử dụng nitơ lỏng (-196ᵒC). Tuy nhiên, trong điều kiện Trung tâm Chẩn đoán trước sinh và Hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên chưa có bình trữ nitơ lỏng, bên cạnh đó Bộ môn Mô – Phôi thai học được trang bị tủ lạnh -35ᵒC và -85ᵒC nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ -85ᵒC nhằm mục tiêu “Đánh giá chất lượng tinh trùng sau bảo quản ở nhiệt độ -85ᵒC tại thời điểm sau 15 ngày và sau 30 ngày”.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu 40 mẫu tinh dịch của nam giới sau khi được thực hiện xét nghiệm tinh dịch đồ tại Trung tâm Chẩn đoán trước sinh và Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện Trường Đại học Y-Dược Thái Nguyên từ tháng 01/2023 đến tháng 08/2023.

Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang

Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu

- Nghiên cứu này được tiến hành trên tất cả các mẫu tinh dịch phù hợp với tiêu chuẩn.

- Cỡ mẫu: toàn bộ, 40 mẫu tinh dịch.

- Phương pháp chọn mẫu: có chủ đích.

- Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu: Các đối tượng đến xét nghiệm tinh dịch đồ tại Trung tâm, mẫu tinh dịch có thể tích từ 1ml trở lên, đồng ý tham gia nghiên cứu.

- Tiêu chuẩn loại trừ: Mẫu tinh dịch lẫn máu, bạch cầu (+); mẫu xuất tinh ngược dòng; 100% tinh trùng di động tại chỗ hoặc bất động; mẫu trích xuất từ mào tinh hoặc tinh hoàn; mẫu thiểu tinh nặng, mật độ dưới 5 triệu/ml; mẫu vô tinh.

Biến số (chỉ số) nghiên cứu

- Đặc điểm chung của đối tượng: tuổi, BMI, số ngày kiêng xuất tinh.

- Chỉ số nghiên cứu trước bảo quản: Thể tích, mật độ, tổng số tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng di động, tỷ lệ hình thái bình thường.

- Chỉ số nghiên cứu sau bảo quản: Mật độ, tổng số tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng di động, tỷ lệ hình thái bình thường, chỉ số sống lạnh (CSF): CSF di động, CSF di động tiến tới, CSF sống.

Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

- Cách đo lường biến số/chỉ số:

+ Chỉ số CSF di động = x100%

+ Chỉ số CSF di động tiến tới = x 100%

+ CSF sống = x100%

- Kỹ thuật xét nghiệm tinh dịch đồ: theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) 2021.

- Kỹ thuật bảo quản lạnh tinh trùng

+ Môi trường bảo quản lạnh: SpermFreeze, Vitrolife

+ Mỗi mẫu sử dụng 01ml tinh dịch, được bổ sung dung dịch SpermFreeze bằng cách nhỏ từng giọt vào mẫu và lắc đều (5 giây/ 1giọt), theo tỉ lệ 0,7 ml môi trường/1 ml tinh dịch. Sau đó, để mẫu ổn định ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 10 phút.

+ Mẫu bảo quản được đưa vào cryotubes và tiến hành đông lạnh. Đặt các cryotubes vào tủ lạnh -35ᵒC trong 30 phút rồi lấy ra thật nhanh chuyển sang tủ lạnh -85ᵒC và lưu trữ.

+ Rã đông: đưa mẫu ra khỏi tủ lạnh -85ᵒC ở các thời điểm 15 ngày và 30 ngày. Để mẫu ở nhiệt độ phòng (24 - 26°C) trong 5 phút. Đặt mẫu vào nước 37°C trong 10 phút để rã đông hoàn toàn. Đánh giá chất lượng sau bảo quản.

- Phương pháp xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS 20.0.

+ Thống kê mô tả: tần số, tỷ lệ, giá trị trung bình, độ lệch chuẩn

+ So sánh giá trị trung bình giữa các chỉ số tinh sau bảo quản ở 2 thời điểm 15 ngày, 30 ngày bằng thuật toán Paired Samples T Test, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

Đạo đức nghiên cứu

Nghiên cứu này chỉ hoàn toàn phục vụ mục đích khoa học, mẫu sau khi đánh giá chất lượng sau bảo quản lạnh sẽ được hủy toàn bộ. Nghiên cứu được sự chấp thuận của Hội đồng đạo đức Y sinh học Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Bảng 1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu

Kết quả Bảng 1 cho thấy: Tuổi trung bình của nhóm đối tượng là 32,23 ± 5,98, thấp nhất là 19 tuổi, cao nhất là 43 tuổi. BMI trung bình là 23,34 ± 2,79 kg/m². Số ngày kiêng xuất tinh trung bình là 4,15 ± 1,44 ngày.

Bảng 2. Đặc điểm tinh dịch đồ trước bảo quản

Kết quả Bảng 2 cho thấy: Các thông số về thể tích, mật độ, tổng số tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng di động và di động tiến tới có giá trị trung bình nằm trong giới hạn bình thường. Tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường trung bình là 3,55 ± 1,87%.

Đánh giá kết quả bảo quản lạnh tinh trùng bằng tủ lạnh âm sâu -85ᵒC sau 15 ngày và sau 30 ngày

Bảng 3. Khả năng di động và tỷ lệ sống của tinh trùng sau bảo quản lạnh

Sau bảo quản 15 ngày và 30 ngày tỷ lệ tinh trùng sống, di động và di động tiến tới ở nhóm 2 giảm so với nhóm 1 có ý nghĩa thống kê (p < 0,01) và thấp hơn giá trị bình thường theo tiêu chuẩn WHO 2021.

Tỷ lệ tinh trùng sống ở nhóm 1 trung bình là 54,83 ± 10,85%, nằm trong giới hạn bình thường theo WHO 2021 (≥54%). Tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường không có sự khác biệt giữa 2 nhóm bảo quản lạnh sau 15 ngày và 30 ngày (p> 0,05).

Bảng 4. Các chỉ số CSF sau bảo quản lạnh 15 ngày và 30 ngày

Các chỉ số CSF di động tiến tới, CSF di động và CSF sống sau 30 ngày bảo quản lạnh đều thấp hơn so với thời điểm 15 ngày, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01.

BÀN LUẬN

Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện tại Trung tâm Chẩn đoán trước sinh và Hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện trường Đại học Y Dược Thái Nguyên. Đối tượng chủ yếu là nam giới trong độ tuổi sinh sản, trung bình là 32,23 ± 5,98. Các đối tượng có thời gian kiêng xuất tinh trung bình là 4,15 ± 1,44 ngày, phù hợp với khuyến cáo của WHO 2021 (3 đến 5 ngày), đây là khoảng thời gian hợp lý để có chất lượng tinh dịch tốt nhất⁴.

Đặc điểm chung của mẫu tinh dịch đồ trước bảo quản có các chỉ số về thể tích, mật độ, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới nằm trong ngưỡng giới hạn bình thường theo WHO 2021. Tuy nhiên, do đối tượng đến thực hiện xét nghiệm tinh dịch đồ tại Trung tâm là những người gặp vấn đề về sức khỏe sinh sản hoặc kiểm tra sức khỏe nên vẫn có những mẫu tinh dịch chất lượng kém hơn. Có 10% trường hợp mật độ tinh trùng dưới 16 triệu/ml, 15% trường hợp có tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới dưới 30% và có đến 52,5% trường hợp tinh trùng hình thái bình thường dưới 4%. Đối với những mẫu tinh trùng số lượng ít, chất lượng kém có thể ảnh hưởng đến kết quả sau bảo quản lạnh, điều này đòi hỏi nhiều nghiên cứu khác mở rộng hơn cho những nhóm đối tượng cụ thể với những phương pháp bảo quản mới phù hợp.

Chúng tôi đưa môi trường bảo quản lạnh về nhiệt độ phòng trước khi pha vào tinh dịch. Trong nghiên cứu này, đảm bảo đúng tỷ lệ 0,7 ml môi trường bảo quản/1ml tinh dịch, thao tác nhẹ nhàng để đảm bảo tinh trùng ít bị tác động đột ngột bởi môi trường, bằng cách nhỏ từ từ từng giọt với tốc độ 5 giây/1giọt vào mẫu tinh dịch và lắc đều. Tác giả Sieme và Oldenhof (2015) cho rằng cách bổ sung chậm như vậy giúp tránh stress do thay đổi áp suất thẩm thấu cho tinh trùng⁵. Sau đó để mẫu ổn định 10 phút ở nhiệt độ phòng trước khi bảo quản lạnh. Mẫu sau khi bổ sung SpermFreeze cần để ở nhiệt độ phòng, không được đặt trong tủ ấm vì nhiệt độ càng cao, tính độc của glycerol với tế bào càng tăng. Thời gian này có tác dụng để glycerol trong môi trường ngoại bào trao đổi nước qua màng tế bào với môi trường nội bào.

Trong quá trình bảo quản lạnh, do xảy ra hiện tượng shock lạnh nên tỷ lệ tinh trùng sống sót sau bảo quản sẽ giảm đi ở mẫu chất lượng kém và ở cả những mẫu có chất lượng bình thường⁶. Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ tinh trùng sống sau bảo quản lạnh 30 ngày (45,05 ± 12,77%) giảm hơn so với 15 ngày (54,83 ± 10,85%) và so với trước bảo quản (77,53 ± 8,16%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Tương tự với đó là chỉ số CSF sống của nhóm bảo quản lạnh sau 30 ngày cũng thấp hơn đáng kể so với nhóm 15 ngày (p < 0,01). Kết quả này cao hơn nghiên cứu của Phạm Hồng Minh và cs (2020) với phương pháp hạ nhiệt tương tự nhưng lưu trữ trong nitơ lỏng cho tỷ lệ sống sau 30 ngày là 36,53 ± 7,88%, sau 10 ngày là 43,93 ± 6,07%⁶. Điều này có thể gợi ý rằng, nếu bảo quản lạnh tinh trùng trong thời gian gian ngắn ngày có thể thực hiện trong điều kiện tủ lạnh âm sâu -85ᵒC mà không cần bước lưu trữ trong nitơ lỏng.

Shock lạnh khiến cho khả năng di động của tinh trùng luôn thấp hơn mẫu tươi⁷. Sau rã đông, tỷ lệ di động và tỷ lệ di động tiến tới trong nghiên cứu của chúng tôi ở thời điểm 30 ngày thấp hơn so với thời điểm 15 ngày và so với trước bảo quản, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 (bảng 3). Kết quả này phù hợp với các kết quả đã được báo cáo của nhiều tác giả về khả năng di động của tinh trùng sau bảo quản. Theo Hiệp hội Ngân hàng mô Hoa Kỳ, tiêu chuẩn chất lượng tinh trùng cần đạt được sau bảo quản lạnh là tỷ lệ tinh trùng di động sau rã đông ≥ 50% so với trước bảo quản⁸. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy chỉ số CSF di động và di động tiến tới đều giảm, ở thời điểm sau 15 ngày đạt yêu cầu đề ra. Tuy nhiên ở thời điểm sau 30 ngày chỉ số CSF di động đạt trên 50% nhưng CSF di động tiến tới (49,07 ± 19,98%) chưa đạt được mục tiêu so với trước bảo quản của Hiệp hội Ngân hàng mô Hoa Kỳ. Như vậy, việc lưu trữ tinh trùng bằng tủ lạnh -85ᵒC càng lâu càng làm giảm chất lượng tinh trùng, do đó phù hợp với những đối tượng có nhu cầu lưu trữ ngắn ngày ở những Trung tâm không có điều kiện lưu trữ trong nitơ lỏng.

Nghiên cứu của chúng tôi không thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong tỷ lệ hình thái tinh trùng bình thường ở 2 thời điểm đánh giá (p > 0,05) (bảng 3). Đặc trưng cấu trúc của tinh trùng đã được biệt hóa cao độ, tỷ lệ nước trong tế bào thấp, bào quan đơn giản, nhân tế bào được cô đặc; vì vậy sau khi trộn cùng môi trường Sperm Freeze, chất bảo quản đã thay thế gần như toàn bộ lượng nước trong tế bào, việc hình thành tinh thể đá bên trong tế bào sẽ ít hơn so với các loại tế bào và mô thông thường khác. Kết quả của chúng tôi có thể do lựa chọn mẫu nghiên cứu là các mẫu tinh dịch chất lượng ban đầu tương đối tốt về hình thái, mật độ và khả năng di động. Chúng tôi cũng đông mẫu tinh trùng tươi mà không qua lọc rửa để giữ lại một số chất cần thiết trong tinh tương đóng vai trò bảo vệ tự nhiên, góp phần hạn chế các tổn thương do shock lạnh gây ra. Việc lọc rửa tinh trùng đã loại bỏ được các tinh trùng chết, tinh trùng có bất thường về hình thái, bạch cầu, vi khuẩn, các yếu tố bất hoạt hoặc các gốc oxy hoạt động nhưng đồng thời cũng loại bỏ các chất cần thiết chống shock lạnh có trong tinh tương. Tinh tương rất giàu những chất sinh năng lượng như fructose - chất cung cấp năng lượng chủ yếu cho sự di động của tinh trùng. Ngoài ra, tinh tương còn chứa kẽm - ion kim loại đóng vai trò duy trì sự toàn vẹn của màng tinh trùng. Mất kẽm do lọc rửa đồng nghĩa với mất vai trò bảo vệ tự nhiên của tinh tương. Một cơ chế bảo vệ tự nhiên chống shock lạnh quan trọng khác là sự có mặt của các chất chống oxy hóa trong tinh tương như superoxide dismutase và catalase; những chất này có tác dụng chống lại các chất oxy hoạt động⁷.

KẾT LUẬN

Tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng di động và di động tiến tới ở thời điểm sau bảo quản lạnh bằng tủ lạnh -85ᵒC 30 ngày giảm so với thời điểm 15 ngày, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01); tỷ lệ hình thái tinh trùng bình thường không có sự khác biệt giữa thời điểm bảo quản lạnh; chỉ số CSF di động sau bảo quản 15 ngày và 30 ngày đạt tiêu chuẩn của Ngân hàng mô Hoa Kỳ. Có thể sử dụng tủ lạnh -85ᵒC để bảo quản lạnh tinh trùng trong thời gian ngắn ở đơn vị không có bình trữ nitơ lỏng. Mẫu sau bảo quản lạnh đạt điều kiện sử dụng để thực hiện các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản.

KHUYẾN NGHỊ

Ở những đơn vị hoặc trung tâm không có bình trữ nitơ lỏng, có thể áp dụng bảo quản lạnh tinh trùng bằng tủ lạnh -85ᵒC ở những trường hợp cần lưu trữ trong thời gian ngắn như: người chồng vắng mặt, người chồng cần điều trị bệnh lý ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng, người chồng xuất tinh được ít tinh dịch cần gom mẫu trong ngày sử dụng mẫu tinh trùng để làm kỹ thuật hỗ trợ sinh sản.